西湖云谷智药团队破解CRISPR高保真编辑难题，延长sgRNA让SuperFi-Cas9实现精准高效编辑

CRISPR基因组编辑技术源自细菌的适应性免疫系统，通过一种可编程RNA序列能够引导CRISPR核酸酶在哺乳动物细胞中识别互补序列，实现对特定基因位点的精准编辑，在生物医学领域有巨大的开发潜力。 但长期以来，高保真与高效率难以兼得成为制约其临床转化的核心难题——高保真Cas9变体虽能大幅降低脱靶风险，却普遍存在靶向切割活性显著下降的问题。

2026年3月18日，西湖实验室马丽佳、黄晶团队在Nature Structural and Molecular Biology发表了题为 "Improving the efficiency of High-Fidelity Cas9 by enhancing PAM-distal interactions" 的研究论文，介绍了团队在CRISPR高保真编辑领域取得的突破性进展。 研究团队首创sgRNA间隔区（spacer）延长策略，仅通过将向导RNA（sgRNA）的间隔区从常规20个核苷酸延长至21-22个核苷酸，就成功恢复高保真酶SuperFi Cas9的切割活性，同时保留其超高特异性，让高保真Cas9实现“精准且高效”。 该成果为基因编辑及CRISPR技术的临床安全应用开辟全新路径。同时，团队应杂志邀请，同期发表了"Extending guide RNA length re-stores high-fidelity CRISPR-Cas9 activity"的研究简报，介绍该项工作。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41594-026-01753-3

行业痛点：高保真Cas9“精准有余、效率不足”

在细菌的免疫系统中，为了快速识别并切割病原体，天然CRISPR核酸酶对错配序列具有一定程度的灵活性。然而，如果要将该核酸酶用于基因组编辑，则需要精确的靶向和编辑。

近年来，多项研究针对CRISPR核酸酶，尤其是SpCas9，开展了工程化改造，成功开发出多种高保真核酸酶变体，能够显著减少脱靶编辑的发生。 但这类工程化酶在提高特异性的同时，也降低了酶的靶向编辑效率。最近一项研究在RuvC结构域引入7个互作残基突变为带负电荷的天冬氨酸，设计了一种新型高保真酶SuperFi-Cas9，旨在不降低靶向编辑效率的前提下提升编辑特异性。 然而后续研究表明，SuperFi-Cas9还是出现了预期之外的活性降低，成为高保真CRISPR工具的共性难题。

突破发现：延长sgRNA，激活高保真酶活性

团队通过高通量编辑实验评估，首次发现SuperFi Cas9在常规使用的20-ntsgRNA之外，对PAM远端第21位核苷酸存在独特序列偏好，提示PAM远端靶点序列相邻区域对SuperFi-Cas9的切割活性至关重要。

为验证该假设，团队设计5'端延长的sgRNA（长度21-24核苷酸），实验验证显示：
• 与传统的20-nt sgRNA spacer序列相比，21-nt或22-nt的spacer序列可有效恢复SuperFi-Cas9的切割活性，同时维持其高保真特性。
• 携带5'端延伸sgRNA的SuperFi-Cas9在内源位点的切割活性可达野生型spCas9的97.1%。

机制解密：冷冻电镜揭示“电荷补偿”核心原理

团队通过冷冻电镜技术，揭示了5' 端延长的sgRNA恢复SuperFi-Cas9活性的机制。 SuperFi-Cas9在RuvC结构域中引入的带负电荷的残基突变，由于和sgRNA-靶向链（target strand, TS）双链互斥，导致PAM远端的局部结构稳定性缺失，从而削弱了切割活性。 延长的sgRNA可通过与RuvC结构域中包含Lys929、Lys948和Arg951的环结构相互作用，补偿缺失的局部稳定性。 与野生型SpCas9相比，该区域在SuperFi-Cas9的靶向编辑过程中发挥着更为关键的作用。

工具应用：AI模型一键优选最佳sgRNA

除了长度，spacer序列的组成也显著影响切割效率。为优化基因编辑中的靶点选择和spacer长度设计，团队自主开发了深度学习模型AIdit-SuperFi，用于预测不同长度sgRNA引导的SuperFi-Cas9系统的编辑效率与特异性。 该模型提供配备用户友好的图形界面，可通过https://aidit-superfi.wllsb.edu.cn/访问和使用，可辅助设计最优间隔区长度，实现SuperFi-Cas9的高效高保真CRISPR基因编辑。

西湖大学博士研究生郑嵘、西湖云谷智药陆志科、魏荣巍、南方科技大学Young-Cheul Shin博士、西湖大学博士研究生杜江为本论文的共同第一作者。 西湖实验室、西湖大学马丽佳研究员（现昌平实验室领衔科学家）和黄晶研究员为本文共同通讯作者。 本研究受到西湖实验室资助，由西湖云谷智药共同参与完成。

关于西湖云谷智药
西湖云谷智药致力于将人工智能技术赋能基因治疗方法研发，依托全链路基因治疗技术平台，现已实现自主知识产权的AAV递送载体、基因编辑工具开发等多项技术突破。 公司已生成大量经非人灵长类动物验证的AAV变体实现精准肝外靶向，其中AAV in vivo CAR-T通过工程化改造AAV变体在体内特异性靶向人T细胞，使基因治疗适应症从罕见病扩展到常见病，为罕见病、肿瘤、自免等疾病开发安全、高效、可及的基因治疗创新疗法，将解决更多未被满足的临床需求。

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